Объемная микроскопия клеточных структур
и микрофлоры эпителия трахеи крысы

П.Р. Казанский, В.Я. Шкловер

ООО «Системы для микроскопии и анализа», ул.Новая, 100, д.Сколково,
Московская обл., Россия

В последнее время все большую актуальность приобретают  методы объемной микроскопии и средства 3D-визуализации микроструктур: объемные реконструкции исследуемого объекта выполняются в макро-, микро- и субмикронном/нанометровом масштабе, позволяющие лучше понять пространственные взаимоотношения элементов исследуемого объекта на разных уровнях структурной детализации и получить полную морфологическую картину – от органа до клетки и субклеточных структур.

В настоящей работе для объемной визуализации клеточных структур с нанометровым разрешением использовался метод послойной резки посредством фокусированного ионного пучка специально подготовленного для электронно-микроскопического исследования образца ткани с последовательной съемкой полученных сечений в обратно-отраженных электронах (FIB/SEM Slice&View) [4]. На основе полученной серии последовательных послойных изображений средствами специализированного программного обеспечения реконструировался объем исследуемого объекта. При этом разрешение трехмерной реконструкции определялась минимальной (стабильно воспроизводимой) толщиной удаляемого ионным пучком слоя материала и составляла величину порядка 10 нм.

Слизистая оболочка трахеи выстлана реснитчатым псевдостратифицированным столбчатым эпителием (ciliated pseudostratified columnar epithelium), состоящим из клеток следующих типов: ciliated cells, brush cells и goblet cells. Выполненные 3D-реконструкции поверхности клеток эпителия сегментированы, каждая клетка выделена своим цветом.

Основной интерес в данной модели представляет выявленная бактериальная флора и ее взаимодействие с эпителиальными клетками. Колония микроорганизмов преимущественно расположена на клеточной границе, которая представляет собой особенность рельефа поверхности. Необходимо отметить, что бактерии преимущественно расположены между клеточных ворсинок и имеют плотный контакт с поверхностью цитоплазматической мембраны. Было показано, что бактерии преимущественно занимают пространство свободное от ресничек, что может свидетельствовать о том, что моторная активность цилий заставляет их избегать взаимодействия с ними[1]. Однако в литературе описаны случаи, когда бактерии, напротив, закрепляются на поверхности ресничек, оставляя свободной цитоплазматическую мембрану[1,3]. Данный тип взаимодействия микроорганизмов с эпителием является симбиозом, однако установить тип симбиоза сложно ввиду способности бактерий одновременно выступать в роли паразита и комменсала в зависимости от ситуации [1].

Также было показано, что бактерии формируют “стебельки” (stalks) для закрепления на поверхности клеток и лучшего доступа к питательным веществам за счет увеличенного соотношения площади к объему [2]. Кроме того, в модели зафиксирован процесс почкования клеток, проводящийся посредством “стебельков” (stalk formation). На основе морфологии клеток, а также расположении на поверхности мембраны можно предположить принадлежность бактерии к роду Mycoplasma, которые являются главным образом поверхностными паразитами [3].

Рис. 1. Слева – снимок отдельного среза ткани (РЭМ) и объемная реконструкция, справа – фрагмент сегментированной реконструкции клеточных структур и микрофлоры эпителия трахеи крысы.

Предложенный подход позволяет исследовать защитные механизмы, реализуемые эпителием трахеи в отношении бактериальной флоры, определять типы симбиотического взаимодействия микрофлоры с эпителием.

1. Zielinski, G. C., & Ross, R. F. (1993). Adherence of Mycoplasma hyopneumoniae to porcine ciliated respiratory tract cells. American journal of veterinary research,54(8), 1262-1269.

2. McAdams, H. H. (2006). Bacterial stalks are nutrient-scavenging antennas. Proceedings of the National Academy of Sciences, 103(31), 11435-11436.

3. Rottem, S. (2003). Interaction of mycoplasmas with host cells. Physiological reviews, 83(2), 417-432.

4. Целуйко С.С., Вислобоков Н.А., Казанский П.Р. и соавт. Новый метод изучения ультраструктурной пространственной организации покровного эпителия слизистой оболочки трахеи. // Бюллетень физиологии и патологии дыхания, 2012, № 45, С. 52-56.